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流式細胞術在過去30年里得到迅速發展，在免疫學、分子生物學、細菌學、病毒學、癌癥生物學和傳染病學等領域得到廣泛應用。比如，流式細胞術對研究免疫系統狀態及其對傳染病和癌癥的反應非常重要，它可以表征來自血液和骨髓的混合細胞群，以及由淋巴結、脾、粘膜組織、實體腫瘤等固體組織分解成的單個細胞。除了分析細胞外，流式細胞術另一個主要應用是對細胞進行分選，以滿足使用者進一步的分析需求。本文將主要以免疫學和分子生物學為例，介紹流式細胞術在實際中的應用。
免疫分型
免疫分型在流式細胞術的應用中最常見，它利用流式細胞術的獨特能力同時分析混合細胞群的多個參數。免疫分型最基本的形式就是使熒光偶聯抗體與細胞表面對應的抗原特異性結合，之后利用流式細胞儀，根據細胞表面的熒光對細胞做出分析。大多數抗原都有特定的分化亞群編號或者CD編號，對應的抗體用相同的方式命名。
大多數免疫細胞都有特定的CD標記，這些細胞標記稱為譜系標記，用于定義特定細胞群，以便在每個免疫分型實驗中進行額外分析。例如T細胞標記物(CD3, CD4, CD8)， B細胞標記物(CD19, CD20)，單核細胞標記物(CD14, CD11b)和NK細胞標記物(CD56, CD161)。
除了定義細胞群的譜系標記外，還使用其他標記來描述每個細胞群的特征。這些標記包括激活標記(CD69、CD25、CD62L)、記憶標記(CD45RO、CD27)、組織歸巢標記(α4/β7)和趨化因子受體標記(CCR7、CCR5、CXCR4、CCR6)等。通常，免疫分型還針對細胞內標記物，如FoxP3(定義Treg細胞)、細胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2定義Th1細胞)、增殖標記物(Ki67、CFSE)和抗原特異性標記物等。
抗原特異性反應
在抗原特異性反應中，使用特定抗原刺激細胞，之后通過MHC多聚體來尋找細胞因子產生、細胞增殖、細胞激活、細胞記憶或抗原識別等。MHC多聚體是生物素化的MHC單體(MHC-I或MHC-II)以四聚體、五聚體或右旋聚體的形式結合在熒光鏈霉親和素骨架上。這些MHC多聚體被“裝上”特定的抗原，之后與識別該抗原的T細胞結合，用來表明T細胞對特定抗原的反應水平?？乖禺愋苑磻ǔＳ糜谝呙缪芯?。
胞內因子檢測
胞內細胞因子檢測通常使用蛋白轉運抑制劑(Brefeldin A或Monensin)處理細胞2-12小時，使細胞產生的各種細胞因子在胞內積累，便于更好地檢測。在這個處理過程中，細胞可以被各種抗原刺激（例如疫苗中的多肽），以檢測細胞的免疫反應。在蛋白質轉運抑制劑處理完畢后，對細胞進行活力標記和細胞表面標記染色，之后進行固定和滲透，以使細胞因子抗體進入細胞內染色。
細胞增殖檢測
細胞增殖可以通過幾種不同方法來測定，這些方法可靶向與細胞增殖相關的事件，例如將胸苷類似物 (BrdU) 摻入復制中的DNA、可遺傳永久染料的世代跟蹤、增殖相關抗原(Ki67、PCNA)的表達檢測等。
細胞凋亡檢測
流式細胞術利用與凋亡相關的級聯事件的靶點進行細胞凋亡檢測：膜聯蛋白 V （Annexin V）靶向易位的細胞質膜進行染色；TUNEL(TdT dUTP Nick End Labeling)靶向內切酶消化的DNA進行標記；抗體和染料靶向半胱天冬酶（Caspases）的激活；確定線粒體膜電位的染料靶向線粒體凋亡；Hoescht 33342靶向細胞核中的染色質凝聚。
Annexin V是一種磷脂結合蛋白，能夠與細胞凋亡過程中被轉運到細胞膜外表面的磷脂酰絲氨酸結合。Annexin V應與排除活性染料(如碘化丙啶)聯合使用，以確保Annexin V與磷脂的結合發生在細胞膜外表面。
TUNEL是一種利用末端脫氧核苷酰轉移酶(TdT)的能力，用dUTP(脫氧尿苷三磷酸)或BrdU標記與凋亡相關的DNA斷裂末端的技術。dUTP或BrdU用熒光色素標記用于檢測，在數據采集之前用DNA染料對細胞進行反染色。
Caspase信號通路會在大多數細胞凋亡過程中被激活，其產生的活化Caspase 3能夠被相應的細胞內染色劑和抗體特異性結合。
檢測線粒體凋亡最常用的方法是使用染料JC-1來檢測線粒體膜電位。此外，有一種抗體可針對APO2.7——一種僅在細胞凋亡過程中表達且定位于線粒體膜上的蛋白。
熒光蛋白檢測
熒光蛋白(GFP、mCherry、YFP、mRuby等)常被用作蛋白質表達的標記，即細胞被轉染含有啟動子序列、目的基因序列和熒光蛋白序列的質粒。當目的基因表達產生目的蛋白時，其下游的熒光蛋白基因共同表達，從而使細胞發出熒光信號。該技術應用于多種研究，例如在體內追蹤移植細胞，檢測細菌或病毒感染，以及鑒定基因功能等。
細胞周期檢測
細胞周期檢測使用飽和量的DNA結合染料對DNA進行染色。在大多數情況下，使用70%乙醇溶液固定細胞，使細胞通透，然后使用染料(PI, 7AAD, DAPI)染色。此外，個別染料可以進入活細胞，在不傷害細胞的情況下染色DNA，比如Hoescht 33342。在細胞周期檢測中，以低流速線性放大的方式采集樣本，然后使用倍性建模軟件進行分析，以確定細胞周期階段。
細胞分選
細胞分選利用流式細胞分選儀來分離純化細胞或顆粒以供進一步分析?；旧?，任何具有熒光的細胞或顆粒都可以被分選。細胞可以被分選到96孔板、384孔板、管中和載玻片上。常見的樣本有表達熒光蛋白的轉染細胞、干細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞、腫瘤細胞和白細胞群。細胞分選需要考慮的一個主要因素，是對大量細胞進行染色時，增加所需的抗體量。
絕對細胞計數
絕對細胞計數可用于任何免疫分型研究，該技術利用隨樣本一起采集的已知濃度的熒光珠對樣本進行分析，并將目的細胞群的門控數量與在同一樣本中獲得的熒光珠數量進行比較，以計算生成單位體積內的細胞數量。
小顆粒檢測和分選
使用高靈敏度的流式細胞儀，可以檢測和分選外泌體和其他亞微米顆粒。細胞外泌體、病毒和其他顆粒的分析在多個領域得到應用，包括癌癥生物學、癌癥治療和疫苗開發。
隨著不斷發展，近年來，流式細胞術也開始在吞噬作用分析、多重微珠陣列檢測、細胞定量分析等研究中得到應用。
